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May 12, 2023

SARS에 대한 mRNA 백신의 포괄적인 1차 구조 특성 분석을 가능하게 하는 질량 분석법을 통한 올리고뉴클레오티드 매핑

과학 보고서 13권,

Scientific Reports 13권, 기사 번호: 9038(2023) 이 기사 인용

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직렬 질량 분석법(LC-UV-MS/MS)과 결합된 UV 검출 기능을 갖춘 액체 크로마토그래피를 통한 올리고뉴클레오티드 매핑은 최근 SARS-CoV-2 바이러스에 면역이 되는 세계 최초의 상업용 mRNA 백신인 Comirnaty의 개발을 지원하기 위해 개발되었습니다. 치료 단백질 양식의 펩타이드 매핑과 유사하게, 여기에 설명된 올리고뉴클레오티드 매핑은 효소 분해, 정확한 질량 측정 및 최적화된 충돌 유도 단편화를 통해 mRNA의 직접적인 1차 구조 특성 분석을 제공합니다. 올리고뉴클레오티드 매핑을 위한 샘플 준비는 신속한 단일 포트, 단일 효소 분해입니다. 다이제스트는 확장된 구배를 사용하여 LC-MS/MS를 통해 분석되며 결과 데이터 분석에는 반자동 소프트웨어가 사용됩니다. 단일 방법에서 올리고뉴클레오티드 매핑 판독에는 재현성이 뛰어나고 최대 서열 범위가 100%인 완전히 주석이 달린 UV 크로마토그램과 5' 말단 캡핑 및 3' 말단 폴리(A)-테일 길이의 미세 이질성 평가가 포함됩니다. 올리고뉴클레오티드 매핑은 구조 동일성과 기본 구조 확인, 제조 공정 변경 후 제품 비교 가능성 평가를 제공함으로써 mRNA 백신의 품질, 안전성 및 효능을 보장하는 데 중추적인 역할을 했습니다. 보다 광범위하게, 이 기술은 일반적으로 RNA 분자의 1차 구조를 직접 조사하는 데 사용될 수 있습니다.

화이자-바이오엔테크(Pfizer-BioNTech)의 코미르나티(Comirnaty)와 모더나(Moderna)의 스파이크백스(Spikevax)라는 두 가지 메신저 RNA(mRNA) 백신이 2019년 코로나바이러스감염증-19(COVID-19) 팬데믹에 대처하기 위해 FDA, EMA 및 전 세계 기타 규제 기관의 승인을 받았습니다1,2. COVID-19는 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스-2(SARS-CoV-2) 감염으로 인해 발생합니다3. mRNA 백신은 표적 면역원성 단백질4의 자가 번역을 위한 유전적 지침을 포함하고 있으므로 예방접종에 사용될 수 있습니다. 승인된 코로나19 백신의 mRNA는 S-2P 단백질5을 암호화하며5 이는 융합전 구조를 유발하는 두 가지 안정화 프롤린 돌연변이로 인해 SARS-CoV-2 스파이크 단백질과 다릅니다6.mRNA 약물 물질(DS)은 시험관 내 전사에 의해 제조됩니다( IVT)는 뉴클레오사이드 변형 메신저 RNA(modRNA)를 형성하는 N1-메틸 슈도우리딘과 함께 박테리오파지 T7 폴리머라제를 사용합니다. modRNA DS는 이후 세포 전달 및 분해력으로부터 보호하기 위해 지질 나노입자(LNP)로 캡슐화됩니다. 제형화된 modRNA-LNP는 백신접종을 위해 투여되는 의약품(DP)으로 구성됩니다.

의약품 제조업체는 판매하는 최종 의약품과 백신의 분자 구조, 서열, 이질성 및 불순물을 특성화하고 이해해야 할 무한한 책임이 있습니다. 5'에서 3' 말단까지의 mRNA DS의 일반적인 1차 구조는 다음과 같습니다: 5' Cap, 5' 비번역 영역(UTR), 항원 코딩 영역, 3' UTR 및 3' 폴리아데노신 꼬리(폴리(A) -tail)7 단일 가닥 형식입니다. 번역 능력이 있으려면 mRNA의 5' 말단이 캡핑되어 있어야 하고8 충분한 수의 연속적인 아데노신 뉴클레오티드9가 있는 폴리(A) 꼬리가 있어야 합니다. 5' 캡은 종종 다음 아데노신 또는 구아노신 뉴클레오티드의 리보스의 5' 탄소에 연결된 5' 말단 N7-메틸화된 구아노신 삼인산이며, 이는 또한 2' 탄소10에서 메톡실화될 수 있습니다. 이러한 5' 캡과 폴리(A)-꼬리 속성은 또한 세포 분해 과정으로부터 mRNA를 보호함으로써 안정성을 부여합니다11,12. 5' 캡과 폴리(A)-꼬리 말단을 포함한 전장 mRNA 1차 구조의 무결성은 원하는 제품 품질을 보장하기 위해 면밀히 모니터링되는 백신 DS의 중요한 품질 속성을 나타냅니다.

다중 크로마토그래피 및 전기영동 "올리고뉴클레오티드 매핑" 기술은 지난 수십 년 동안 개발되었습니다. 최근에는 mRNA 백신의 5' Cap16에 대한 심층적인 특성 분석을 위해 질량 분석법(IP RP-HPLC-MS)과 결합된 이온쌍 역상 고성능 액체 크로마토그래피를 활용하는 질량 분석법(MS) 기반 mRNA 특성 분석 방법이 개발되었습니다. 및 3'-폴리(A)-테일17. 그러나 이를 위해서는 각 말단의 특성을 파악하기 위한 정제 및 전용 분석 방법이 필요합니다. 대형 RNA의 올리고뉴클레오티드 시퀀싱을 위해 탠덤 MS(MS/MS) 유무에 관계없이 효소 분해 및 IP RP-HPLC를 활용하는 추가 분석 방법이 최근 개발되었습니다. 다양한 용액 효소22 또는 자성 입자에 고정된 RNase T1이 향상된 서열 범위에 대해 평가되었습니다. Nakayamaet al. 안정 동위원소 표지 표준을 사용하여 LC-MS 기반 mRNA 프로파일링 방법을 개발했습니다. 앞서 논의된 RNA 1차 구조 특성화에 대한 선구적인 작업에도 불구하고포괄적이고 사용하기 쉬운 분석 방법을 갖는 것이 현장에 유익합니다. 간단한 구현에 적합한 이상적인 올리고뉴클레오티드 맵은 5' Cap 및 3' 말단 이질성을 포함하여 RNA의 전체 길이를 1-Pot, 1-효소 분해에서 직접적이고 효율적으로 특성화할 수 있는 것이며 안정 동위원소 표지가 필요하지 않습니다. 통제 수단. 이는 서열 이성질체를 분석하고 최대 서열 적용 범위 맵이 포함된 완전히 주석이 달린 UV 크로마토그램을 생성합니다.