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플라빈의 효소 기능의 진화

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플라빈의 효소 기능의 진화

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Nature Communications 14권, 기사 번호: 1042(2023) 이 기사 인용

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생물학에서의 적응의 분자 메커니즘 중에서 효소 기능의 다양화는 필수불가결합니다. 유기체가 촉매 레퍼토리를 확장하고 근본적으로 다른 화학을 채택하도록 허용함으로써 동물은 새로운 환경에서 노출되는 새로 발견된 물질과 생체이물을 이용하거나 제거할 수 있습니다. 여기에서는 생체이물 해독에 필수적인 플라빈 함유 모노옥시게나제(FMO)를 탐구합니다. 효소학 기술과 결합된 고생물화학 접근법을 사용하여 우리는 네발동물에서 가족의 기능적 다양화를 담당하는 일련의 역사적 대체를 공개합니다. 놀랍게도, 몇 가지 아미노산 대체는 산소화 플라빈 중간체를 조절하여 조상의 다중 작업 FMO를 보다 특화된 모노옥시게나제로 차별화합니다. 우리의 연구 결과는 효소 기능이 활성 부위 핵심에 국한되지 않는 잔류물의 하위 집합에 달려 있다는 지속적인 전제를 입증합니다.

플라빈 함유 모노옥시게나제(FMO)는 척추동물 해독 무기고의 효소이자 핵심 자산입니다1,2. FMO는 일반적으로 헤테로원자를 함유한 분자를 수용성, 쉽게 배설 가능한 산화물로 변환하는 능력으로 알려져 있습니다3. 보다 특정한 헴을 함유한 시토크롬 P450 모노옥시게나제4와는 달리 FMO는 활성 부위 내에 과다한 기질을 수용할 수 있습니다5. 또한 항염증제 및 항암제6,7 활성화의 주요 단계를 촉매하고 타우린8을 포함한 필수 물질의 내인성 합성에도 관여합니다. 이러한 모든 산화에 대해 FMO는 산소 분자(O2)와 NADPH를 수소화물 공여체로 사용합니다. 인간 FMO는 질병 및 장애와 관련이 있으며, 일반적으로 생선 냄새 증후군으로 알려진 트리메틸아민뇨증은 FMO를 코딩하는 유전자의 돌연변이로 인해 발생하는 가장 잘 알려진 예입니다9,10.

인간 게놈은 5개의 FMO 파라로그(FMO1-5)와 유사유전자(FMO6)로 기술된 추가 하나를 암호화합니다. 흥미롭게도 이 5개의 파라로그 배열은 사실상 모든 네발동물에서 보존됩니다. FMO 1-4는 계열에 대해 설명된 표준 반응인 황화물 및 아민(이하 S/N 또는 헤테로원자) 산화8,12를 수행함으로써 본질적으로 동일한 촉매 특성을 공유합니다. 반대로 FMO5는 오랫동안 "의사 활성" FMO13으로 간주되었습니다. Fiorentini et al.은 최근 2016년에 있었습니다. Baeyer-Villiger(이하 BV) 산화로 알려진 반응인 케톤과 알데히드의 C-C 결합에 산소 원자를 삽입함으로써 인간 FMO5가 근본적으로 다른 화학을 수행할 수 있음을 입증했습니다. S/N 및 BV 산화라는 두 가지 다른 화학 반응은 FMO 문헌에서 흔히 "장전된 총"으로 정의되는 일반적인 산소화 반응 중간체인 C4a-(하이드로)퍼옥시플라빈에 의해 매개되는 별개의 촉매 메커니즘에 의해 달성됩니다15,16(그림 . 1). S/N 산화는 전자가 풍부한 기질을 공격하는 양성자화된 플라빈 중간체와 공유된 친전자성 치환 메커니즘을 통해 작동합니다. 반대로, BV 반응은 산소화 플라빈 중간체와 기질 사이에 사면체 부가물(Criegee 중간체)이 형성되는 C4a-퍼옥시플라빈의 탈양성자 형태를 포함합니다. BV 산소화는 촉매 작용과 탄소 중심 이동 중에 형성된 종을 수용하기 위해 활성 부위에 까다로운 구조적 사전 배열을 요구합니다. 포유류 FMO의 재구성에 대한 우리의 이전 연구는 별개의 S/N 및 BV 화학이 이미 포유동물에서 정의되었으며 아마도 각 파라로그 분기군이 출현할 때 정의되었음을 시사하며 이는 두 개의 FMO 품종이 존재함을 암시합니다. 하나는 S/N 전용입니다. 산화(FMO1-4) 및 다른 하나는 BV 산화(FMO5)18,19.

반복되는 분자 구조는 R이 리비틸 아데노신 꼬리에 해당하는 FAD 보조인자의 이소알록사진 부분을 나타냅니다. E는 효소를 의미합니다. 첫째, 산화된 FAD(E-FAD)는 NADPH에 의해 환원됩니다. 환원된 효소(E-FADH2)는 O2와 쉽게 반응하여 산소화 효소 중간체 C4a-플라빈(하이드로)과산화물(E-FADOO(H))을 형성합니다. 여기에서 두 가지 메커니즘, 즉 S/N 산화 또는 BV 산화가 가능하며 둘 다 H2O 및 NADP+의 후속 방출로 이어집니다. 기질이 없으면 효소는 분리(uncoupling)라고 불리는 쓸데없는 과산화수소 생성 주기를 겪습니다.

 0.94) (Supplementary Fig. 3). tAncFMO1-5 (\(\overline{{PP}}\) = 0.95) is the ancestor predating the first duplication event (encompassing all tetrapod FMO paralogs), while tAncFMO5 (\(\overline{{PP}}\) = 0.96) and tAncFMO1–4 (\(\overline{{PP}}\) = 0.94) are its daughter paralogs, ancestors of each functionally diverse lineage. Inside the FMO1–4 clade further duplication events occurred, the first of them originated the FMO4 clade and tAncFMO1–3 (\(\overline{{PP}}\) = 0.95) which was also resurrected. From this ancestor (tAncFMO1–3), the FMO2 group was the next to emerge, followed by FMO1 and FMO3, with the latter duplicating further solely in mammals to give rise to FMO6, a pseudogene in humans21. As the aim of ASR is to recover the phenotype of extinct molecules rather than its precise sequence, uncertainty in the reconstruction has to be taken into account26. Therefore the alternative ancestor sequences (Alt_tAncFMOs) were also obtained. These display the combination of the second-best states at all ambiguously reconstructed sites27 (see Methods)./p> 0.2. The sequences of the alternative ancestors (Alt_tAncFMOs) were generated by including altogether the second-best states for the ambiguously reconstructed sites plus the MAP states (PP > 0.8)./p> 0.8 at both nodes were selected for the next step, as these were considered true substitutions. Also, when at one of the nodes the inspected site was reconstructed with a PP < 0.8 and the alternative state (PP > 0.2) was a different than the MAP state at the other node, it was included in the selection. This first process allowed us to reduce the number of substitutions to inspect to 27. After that, the degree of conservation for each of the selected sites was analyzed employing the ConSurf server51. Those sites identified as conserved either across the entire dataset or just among the heteroatom-oxidative lineage or the BV lineage were further selected. Finally, the structural environment of each of the sites was inspected using the structures of mAncFMO5 (PDB 6SEK) as a model for the BV lineage and mAncFMO2 (PDB 6SF0) as a model for the heteroatom oxidizing lineage. Sixteen sites were detected as candidates to experimentally test. These sites where further divided into three subgroups according to their proximity to the active site and/or conservation degree. Thus 4× included 4 substitutions at the active site, 12× included the substitutions of 4× plus 8 sites and 16× included all the selected sites./p>